Результаты работы института в 2005 г.

В 2005 году Институт биофизики СО РАН выполнял НИР по следующим основным направлениям фундаментальных исследований РАН:

• 5.1. Структура и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов. Биокатализ.

• 5.10. Биохимия и физиология микрорганизмов и грибов. Использование микрогранизмов и грибов в биотехнологии.

• 5.11. Биохимия и физиология растений. Механизмы роста, адаптации и взаимодействия с другими организмами. Фотобиотехнология.

• 5.20. Организация и биосферные функции природных экосистем - лесных, морских, пресноводных и других. Динамика и механизмы устойчивости сообществ.

• 5.24. Воздействие факторов внешей среды на биологические системы. Радиобиология.

• 5.27. Оценка состояния и проблемы сохранения биоразнообразия. Мониторинг.

• 5.28. Научные основы рационального использования и воспроизводства биологических ресурсов.

• 5.30. Математические модели в биологии. Биоинформатика.

В 2005 году продолжались исследования, запланированные на период с 2002 по 2006 гг., в рамках научного направления "Биофизика и биотехнология живых систем, включая замкнутые искусственные и природные экологические системы, моделирование и прогноз их состояния" по пяти бюджетным проектам НИР Института на период 2004-2006 гг. зарегистрированым во ВНТИЦентре с присвоением шифров государственной регистрации:

• Механизмы катализа в биолюминесцентных реакциях четырех типов светящихся организмов (бактерии, кишечнополостные, черви, светляки): общие закономерности и различия. Рег. номер 0120.0 404600

• Исследование структурнофункциональной организации клеточной системы синтеза биополимеров полигидроксиалканоатов (ПГА) для контролируемого синтеза новых материалов и получения конструкций и препаратов медицинского назначения нового поколения. Рег. номер 0120.0 404601

• Особенности миграции биологически активных веществ и элементов природного и антропогенного происхождения в трофической цепи "продуцент - консумент" в водных экосистемах бассейна Енисея (на примере жирных кислот, серы и америция-241) Рег. номер 0120.0 404602

• Биотехнология рационального использования природных ресурсов: исследование структурно-функциональной организации и динамики микробных популяций, окисляющих моно- и дисульфиды восстановленных руд, содержащих благородные металлы. Рег. номер 0120.0 404603

• Оценка пределов устойчивости биосферы с помощью минимальных теоретических и экспериментальных моделей, согласованных с данными глобальных наблюдений, включая спутниковые. Рег. номер 0120.0 404599

В рамках утвержденных планов НИР по проблемам биофизики экосистем и физико-химической биологии получены следующие важнейшие результаты:

По проекту "Механизмы катализа в биолюминесцентных реакциях четырех типов светящихся организмов (бактерии, кишечнополостные, черви, светляки): общие закономерности и различия". Рег. номер 0120.0 404600

С разрешением 1.7 и 2.2 ? определены кристаллические пространственные структуры двух Са2+-регулируемых апо-фотопротеинов - апоакворина и апообелина. Ион кальция обнаружен в каждом из трех сайтов (Рис. 1а), имеющих каноническую аминокислотную последовательность, характерную для всех Са2+-зависимых белков, содержащих Са2+-свзывающие сайты "EF-hand" типа, и координируется в типичной пентагональной бипирамидальной конфигурации. Структуры молекул апоакворина и апообелина, связанные с ионами кальция, сохраняют ту же пространственную организацию, что и молекулы фотопротеинов с субстратом (2-гидропероксицелентеразином) (Рис. 1b) и продуктом реакции (целентерамидом).

Рис. 1. Кристаллическая структура апо-акворина (а). Ионы кальция показаны как красные шарики. Римскими цифрами пронумерованы петли "EF-hand" типа. "EF-hand" II не содержит канонической аминокислотной последовательности для связывания кальция и поэтому не координирует ион кальция. Для сравнения показана молекула акворина (b) с субстратом реакции 2-гидроперокси целентеразином, который располагается в центре молекулы. Молекулы апо-акворина и акворина показаны в одинаковой ориентации.

Из этого было сделано заключение, что Са2+-регулируемые фотопротеины принадлежат к семейству модуляторов кальциевых сигналов таким, как например, парвальбумин, а не к семейству кальциевых сенсорных белков, типичным и наиболее известным представителем которых является кальмодулин. Тем не менее, сравнительный анализ пространственных структур различных конформационных состояний фотопротеинов позволил выявить изменения как в -спиралях, так и в области Са2+-связывающих сайтов, происходящие в результате координации ионов кальция белком. Исходя из этого, предложены последовательность связывания ионов кальция с Са2+-связывающими сайтами фотопротеина и механизм передачи кальциевого сигнала по молекуле фотопротеина, приводящий к запуску биолюминесцентной реакции. При дополнительной поддержке Программы Президиума РАН и СО РАН "Молекулярная и клеточная биология" (грант "Молекулярные механизмы образования эмиттера в биолюминесцентных реакциях различных организмов"), гранта РФФИ 02-04-49419. Руководитель работ: зав. лабораторией фотобиологии, к.б.н. Е.С. Высоцкий, тел. 3912-49-44-30 Кристаллическая структура решена совместно с Университетом штата Джорджия, США.

С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза показано, что различие в спектрах биолюминесценции у двух Са2+-регулируемых фотопротеинов акворина и обелина определяется одной аминокислотой, расположенной в субстрат-связывающей полости фотопротеинов. На примере активации с помощью АТФ эндогенного рецептора P2Y2 клеток китайского хомячка показана применимость мутантных фотопротеинов для мониторинга внутриклеточного кальция при их экспрессии в животных клетках.

Обелин и акворин принадлежат к семейству Са2+-регулируемых фотопротеинов. 2-гидропероксицелентеразин-связывающую полость этих фотопротеинов формируют высоко консервативные аминокислотные остатки; имеется только четыре различающихся остатка в окружении 2-гидропероксицелентеразина. Тем не менее, акворин и обелин отличаются спектрами биолюминесценции (?max = 470 и 485 нм, соответственно). В аминокислотной последовательности обелина в положении 88 находится Phe. У акворина в соответствующей позиции располагается тирозин, OH группа которого образует водородную связь с 6-п-гидроксифенильной группой 2-гидропероксицелентеразина. Соответственно, эта водородная связь отсутствует в обелине. Для определения влияния этих аминокислотных остатков на спектральные характеристики биолюминесценции акворина и обелина методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза были получены мутант обелина с заменой Phe на Tyr и мутант акворина с заменой Tyr на Phe.

Показано, что замена Phe на Tyr в обелине приводит к сдвигу максимума спектра биолюминесценции в коротковолновую область (?max = 453 нм), тогда как замена Tyr на Phe в акворине вызывает сдвиг биолюминесценции в длинноволновую область (?max = 501 нм) (Рис. 2А). Хотя спектры биолюминесценции мутантных обелина и акворина не совпадают точно со спектрами биолюминесценции соответствующих WT фотопротеинов, направленность спектральных сдвигов определенно указывает на то, что именно дополнительная водородная связь, формируемая OH группой Tyr с 6-п-гидроксифенильной группой 2-гидропероксицелентеразина в акворине, определяет разницу в спектральных характеристиках этих фотопротеинов. В то же время, проведенные замены не повлияли на другие параметры биолюминесценции - удельную активность и скорость реакции.

Рис. 2а. Спектры биолюминесценции акворина (А) и обелина (В). Пунктирной линией показаны спектры WT фотопротеинов; сплошной линией - спектры мутантов.

Рис. 2б. Стимуляция эндогенного P2Y2 рецептора в СНО клетках, стабильно экспрессирующих либо WT акворин (пунктирная линия), либо мутантный акворин (сплошная линия) различными концентрациями АТФ (0.3, 1.0, 3.0, 10.0 и 30.0 М).

Мутантные обелин и акворин были стабильно экспрессированы в клетках китайского хомячка (CHO cells). На примере активации эндогенного рецептора P2Y2 CHO клеток АТФ было показано, что по своим свойствам мутантные фотопротеины не отличаются от WT обелина и акворина при их применении для мониторинга внутриклеточного кальция (Рис. 2б). Спектральные максимумы биолюминесценции мутантных фотопротеинов отличаются почти на 50 нм (Рис. 2а). Это открывает потенциальную возможность для разработки двухволновых репортерных систем, которые могут найти применение в одновременном мониторинге внутриклеточного кальция в разных компартментах клетки, активности двух рецепторов, или экспрессии в клетках двух различных генов. При дополнительной поддержке Программы Президиума РАН и СО РАН "Молекулярная и клеточная биология" (грант "Молекулярные механизмы образования эмиттера в биолюминесцентных реакциях различных организмов"), гранта РФФИ 02-04-49419. Руководитель работ: зав. лабораторией фотобиологии, к.б.н. Е.С. Высоцкий, тел. 3912-49-44-30

По проекту "Исследование структурнофункциональной организации клеточной системы синтеза биополимеров полигидроксиалканоатов (ПГА) для контролируемого синтеза новых материалов и получения конструкций и препаратов медицинского назначения нового поколения". Рег. номер 0120.0 404601

Создано и введено в строй первое в России Опытное производство разрушаемых биополимеров гидроксипроизводных монокарбоновых кислот (ПГА) различного состава, содержащих мономеры с длиной углеродной цепи от С4 до С8. Исследованы физико-химические свойства полимеров и методы переработки в изделия из различных фазовых состояний; получена серия изделий биомедицинского назначения (пленки, мембраны, микрочастицы, ультратонкие волокна, композиты с природными и синтетическими материалами). На Опытное производство полимеров и технологию получен сертификат соответствия Государственной санитарно-эпидемиологической службы России; Испытательной лабораторией биологической безопасности медицинских изделий ФГУ НИИТиИО МЗ РФ выдано Заключение о пригодности изделий из ПГА для медицины.

Рис 3. Первое в России опытное производство разрушаемых биополимеров на которое получен сертификат Государственной санитарно-эпидемиологической службы России.

Показана эффективность применения ПГА в качестве матрикса для долговременного депонирования лекарственных препаратов с контролируемым выходом. Разработаны и исследованы на животных внутрисосудистые эндопротезы (стенты), модифицированные полимерным покрытием из ПГА, в том числе нагруженные цитостатическими препаратами; последние позволяют практически полностью предотвратить появление неоинтимального слоя, снижая риск развития рестенозов. В ограниченных клинических условиях показана эффективность использования мембран из ПГА для направленной регенерации костных тканей при хиругическом лечение парадонтоза и в качестве протектора гиалинового хряща суставных поверхностей при артропластике суставов (Гос. рег. 0120.0 404601, д.б.н. Т.Г. Волова, Лаб. хемоавтотрофного биосинтеза ИБФ СО РАН, совместно с ИФ СО РАН, Красноярским стоматологическим центром, Кардиологическим центром Красноярской краевой клинической больницы № 1, НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, Гематологическим научным центром РАМН).

По проекту "Особенности миграции биологически активных веществ и элементов природного и антропогенного происхождения в трофической цепи "продуцент - консумент" в водных экосистемах бассейна Енисея (на примере жирных кислот, серы и америция-241)" Рег. номер 0120.0 404602

Показано, что трансурановый элемент 241Am может накапливаться в биомассе водных растений и микроводорослей. Данные химического фракционирования биомассы гидрофитов показали, что 20% накопленного 241Am прочно связано с биомассой. Прочность связывания 241Am с биомассой подтверждается также низкими значениями выхода 241Am из биомассы в воду в длительных экспериментах (до 127 суток). При отмирании водных растений в аквариуме основная часть 241Am остается связанной с частицами биомассы. Полученные данные позволяют по-новому оценить роль трансурановых элементов в водных экосистемах и прогнозировать их миграцию по пищевым звеньям.

Трансурановые элементы являются новыми элементами для биосферы и не имеют стабильных изотопов. Общепринято, что трансурановые элементы не могут накапливаться в биомассе живых организмов, а могут только адсорбироваться на поверхности. Нами получено, что трансурановый элемент 241Am, который образуется в результате распада плутония и имеет период полураспада 430 лет, может накапливаться в биомассе водных растений и микроводорослей. Данные проведенного по оригинальной методике последовательного химического фракционирования биомассы гидрофитов показали, что в конце опыта основная активность 241Am в биомассе была представлена обменной и адсорбционной фракциями (41% и 38%, соответственно). На долю 241Am, прочно связанного с биомассой элодеи, приходилось 21% общей активности 241Am. Прочность связывания 241Am с биомассой подтверждается также низкими значениями выхода 241Am из биомассы (до 10%) в воду лабораторных аквариумов за длительный период проведенных экспериментов. Начиная с 70 суток опыта в аквариумах наблюдалось интенсивное разложение растений, которое сопровождалось появлением в воде частиц органического происхождения и увеличением активности 241Am в воде. Растение полностью утратило морфологическую структуру и биомасса гомогенизировалась к 110-127 суткам. За этот период элодея потеряла до 65% начальной активности 241Am. Почти вся исходная активность 241Am удерживалась органической массой разложившихся растений. В фильтрованной от взвеси воде активность 241Am не превышала 10% от общей активности 241Am в воде аквариумов. Химическое фракционирование разложившейся биомассы растений показало, что к концу опыта произошло уменьшение обменной фракции с 41 до 17% и увеличение с 21 до 40% фракции 241Am прочно связанного с биомассой. Эти данные свидетельствуют, что в биомассе элодеи за время эксперимента произошла убыль обменной фракции (частично, в результате выхода 241Am в воду) и перераспределения форм 241Am в сторону увеличения фракции прочно связанной с биомассой. Проведенные эксперименты показали, что 241Am связывался и оставался прочно связанным с биомассой даже при отмирании и разложении элодеи. Полученные данные позволяют по-новому оценить роль трансурановых элементов в водных экосистемах и прогнозировать их миграцию по трофическим звеньям. Однако механизмы накопления трансурановых элементов живыми организмами пока не определены. (д.б.н. А.Я. Болсуновкий, лаб. Радиоэкологии)

Рис 4. Динамика накопления (A) и выхода (B) 241Am из биомассы Elodea. А. В конце эксперимента содержание 241Am в обменной и адсорбционной фракциях 41% и 38%, в органической фракции (прочно связан с биомассой) - 21%. B. В конце эксперимента 241Am в обменной и адсорбционной фракциях 17% и 33%, в органической фракции - 40%.

По проекту "Биотехнология рационального использования природных ресурсов: исследование структурно-функциональной организации и динамики микробных популяций, окисляющих моно- и дисульфиды восстановленных руд, содержащих благородные металлы". Рег. номер 0120.0 404603

Исследованы структурно-функциональные особенности функционирования сообщества бактерий, окисляющих сульфидную и элементную серу при выщелачивании концентратов сульфидных руд, содержащих благородные металлы Показана возможность снижения длительности процессов бактериального выщелачивания на 50-80%.

Рис 5. Динамика и максимальная скорость бактериального окисления пирротинового концентрата по традиционной (1) и экспериментальной (2, 3) технологиям.

Исследованы основные факторы, ограничивающие скорость процессов бактериального выщелачивания сульфидных руд благородных металлов, которые связанны с нерастворимостью субстрата и кинетикой окисления сульфидной серы. Показано, что при окислении пиритного концентрата золотосодержащей руды меньшая часть сульфидной серы (до 24%) переходила в элементную форму, то есть окисление основного субстрата (дисульфида) шло по тиосульфатному механизму. Материальный баланс продуктов бактериальной обработки пирротиновых концентратов, содержащих платиновые металлы, соответствовал полисульфидному механизму окисления моносульфидов, первым интермедиатом которого была элементная сера (накопление до 88 - 93%). Таким образом, минералогический состав концентратов определяет соотношение вторичных субстратов (продуктов разложения сульфидов Fe2+, элементной серы и ее растворимых восстановленных соединений), которые служат регулирующим фактором видовой и функциональной структуры смешанной культуры окисляющих концентраты бактерий. При более высокой железоокисляющей активности культуры бактерий относительно сероокисления также может происходить накопление элементной серы, агломерация и, в итоге, снижение скорости окисления. В модельных экспериментах показана возможность увеличения скорости окисления элементной серы до сульфата при изменении концентрации промежуточных продуктов (политионатов). С учетом выявленных особенностей кинетики окисления сульфидной и элементной серы проведены эксперименты, которые показали, что длительность процессов биовыщелачивания сульфидных концентратов можно значительно сократить (на 50 - 80%). (Гос. рег. 0120.0 404603, д.ф.-м.н. Ю.Л. Гуревич, лаб. Экологической биотехнологии ИБФ СО РАН).

По проекту "Оценка пределов устойчивости биосферы с помощью минимальных теоретических и экспериментальных моделей, согласованных с данными глобальных наблюдений, включая спутниковые". Рег. номер 0120.0 404599

Установлено, что вклад океанской биоты в сезонные колебания концентрации СО2 по сравнению с наземной биотой незначителен. Это подтверждается сравнением результатов моделирования с данными измерений обсеравтории Мауна-Лоа.

Создана и проанализирована малоразмерная модель динамики СО2 в земной биосфере, описывающая сухопутную и океаническую биоты, разделенные на широтные компартменты: тропические (от 30ою.ш. до 30ос.ш.), южные (южнее 30ою.ш.) и северные (севернее 30ос.ш.). Наземные компартменты включают биомассу растений и неживое органическое вещество, океанические - биомассу планктона и гетеротрофных организмов. Параметры модели (количество углерода в наземной и океанической растительности, и в почве, а также скорости фотосинтеза, дыхания и антропогенной эмиссии) брались из литературных данных. На основе литературных данных было принято, что океаническая биота ассимилирует 30 ГтС/год при биомассе всего 3 Гт. Это обусловлено высокой скоростью роста, потребления и окисления останков фитопланктона (дни, месяцы), а также обратным соотношением биомасс автотрофов и гетеротрофов, характерного для суши. Верификация модели проводилась на основе данных измерений на Мауна-Лоа по глобальной динамике углекислого газа в атмосфере.

В результате вычислительных экспериментов показано, что вклад океанической биоты в многолетний тренд и сезонные колебания концентрации СО2, по сравнению с вкладом наземной биоты, незначителен (рис. 6) и уступает последнему на два порядка. (Гос. рег. № 0120.0404599, координатор проекта член-корр. РАН А.Г.Дегерменджи, лаборатория теоретической биофизики, д.ф.- м.н. С.И.Барцев; лаборатория экологической информатики, д.т.н. А.П.Шевырногов)

Рис. 6. Динамика наблюдаемых и расчетных концентрации СО2 в атмосфере с учетом вклада морской биоты и без нее: а) на всем интервале наблюдений на Мауна-Лоа; б) более детальный фрагмент, соответствующий диапазону спутниковых наблюдений.